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超微量分光光度計與傳統分光光度計相比有哪些優點
發布時間:2020-03-06   點擊次數:390次

  超微量分光光度計與傳統分光光度計相比有哪些優點
  超微量分光光度計與傳統分光光度計相比,前者具備的獨特優點在于:
  (1)所需樣品體積小,僅需0.5—2μl;
  (2)不需要比色皿,用移液槍直接將樣品滴加到檢測平臺上,測量時樣品自動形成液柱,檢測完成后只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測平臺上擦拭干凈即可,避免了因為比色皿清洗不凈帶來的交叉污染;
  (3)一般具有多個光程(電機控制自動選擇)【BIO-DL MicroDrop基座模式下光程1.0 mm、0.2 mm、0.1 mm 和 0.05 mm自動調整】,而傳統分光光度計的光程為10 mm,超微量分光光度計樣品無需稀釋,測量范圍可達到常規分光光度計的50倍【BIO-DL MicroDrop基座模式下dsDNA檢測范圍:2~15000ng/μl】;
  (4)氙氣閃光燈為燈源,代替了氘燈(紫外)和鎢燈(可見),使用壽命更長;
  (5)不需要預熱,可隨時檢測,檢測時間短【BIO-DL MicroDrop<5秒】;
  (6)顯示吸光度值的同時,程序直接給出濃度值(核酸、蛋白和熒光染料);
  (7)占據實驗室空間體積比傳統分光光度計小很多【BIO-DL MicroDrop重量:2.1kg】。
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  超微量分光光度計不僅涵蓋了可見光分光光度計的功能而且也可以進行紫外分光光度計的應用,常用以下幾方面:
  核酸的定量
  核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率高的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈DNA、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應消光因子。如:1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經過上述系數的換算,從而得出相應的樣品濃度。除了核酸濃度,分光光度計顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。
  UV-VIS常規可見-紫外檢測
  全波長超微量分光光度計可以像普通的紫外-可見分光光度計一樣行使功能。如BIO-DL MicroDrop可以顯示從185到910nm的光波下樣品的吸光值??梢酝瑫r指定檢測40個波長下的吸光值并把數據顯示在報告中。
  蛋白質的直接定量(UV法)
  這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。蛋白質測定過程非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白質。蛋白質直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
  比色法蛋白質定量
  蛋白質通常是多種蛋白質的化合物,比色法測定的基礎是蛋白質構成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關,從而反應蛋白質濃度。
  比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry等幾種方法。
  Lowry法:以早期的Biuret反應為基礎,并有所改進。蛋白質與Cu2+反應,產生藍色的反應物。但是與Biuret相比,Lowry法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時間較長;容易受到非蛋白物質的影響;含EDTA,Tritonx-100,ammoniasulfate等物質的蛋白不適合此種方法。
  BCA(Bicinchoninineacidassay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產生Cu+,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強,反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法,操作簡單,敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。
  Bradford法:這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應,產生的有色化合物吸收峰595nm。其特點是,敏感度好,是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍;操作更簡單,速度更快;只需要一種反應試劑;化合物可以穩定1小時,方便結果;而且與一系列干擾Lowry,BCA反應的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大,無可比性。
  細菌細胞密度(OD600)
  實驗室確定細菌生長密度和生長期,多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗,需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。
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